在elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本物和加結(jié)合物后，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器是水浴箱，可使elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)中的溫度保持平衡。elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)中各elisa板不應(yīng)該疊在一起。為了避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或者將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中，濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。

ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。

elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)中溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些elisa試劑盒試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中一般不予采用。