主要用途

        端粒酶活性TRAP實時定量檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號，結(jié)合端粒重復(fù)序列擴增方法（TRAP），既方便、快速地進行各種DNA模板的擴增，又實時檢測和定量分析擴增產(chǎn)物，即端粒酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應(yīng)用于腫瘤、衰老等研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復(fù)性強，效果滿意，質(zhì)量保證。

技術(shù)背景

         端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白酶（ribonuleoprotein），與人體細胞永生化（immortalization）和轉(zhuǎn)化（transformation）有關(guān)。端粒重復(fù)序列擴增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶聯(lián)擴增的敏感高效的體外端粒酶活性的檢測技術(shù)。首先，非端粒單核苷酸引物作為端粒酶的底物而持續(xù)延長產(chǎn)生六堿基差異的片段；然后，延長所獲得的產(chǎn)物在非端粒單核苷酸引物和逆向引物的參與下進行特異性擴增。SYBR綠色熒光染料，作為DNA結(jié)合染料，可以和擴增子（amplican）上雙鏈DNA的任一小溝（minor groove）結(jié)合，而發(fā)出熒光信號。根據(jù)每一循環(huán)的熒光強度來確定擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量，并用循環(huán)閾值（threshold cycle；Ct）表示。TRAP實時定量PCR技術(shù)十倍敏感于常用TRAP電泳技術(shù)，同時避免二聚體產(chǎn)生的假陽性干擾。

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）  毫升

反應(yīng)液（Reagent B）  微升

染色液（Reagent C）  微升

補充液（Reagent D）  毫升

封隔液（Reagent E）  毫升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；GENMED染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品沉淀收集

PCR管：用于樣品擴增操作的容器

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應(yīng)

實驗提示

• 樣品制備

1）細胞樣品制備

• 準備1個細胞培養(yǎng)6孔板的單孔細胞，直至生長至80％鋪滿率（1 X 10⁵細胞）
• 小心抽去細胞培養(yǎng)液
• 用細胞刮脫棒刮落細胞轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預(yù)冷的裂解液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進冰槽里孵育30分鐘
• （選擇步驟）放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• （選擇步驟）小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 移取5微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

2）組織樣品制備

• 手術(shù)取出動物組織，并秤取50毫克待測組織
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（比較快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進DOUNCE 勻漿器
• 加入xx微升預(yù)冷的裂解液（Reagent A） 
• 勻化80下
• 小心轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進冰槽里孵育30分鐘
• 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取5微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
• 定量檢測
• 一次反應(yīng)總量為25微升
• 移取xx微升反應(yīng)液（Reagent B）到0.5毫升PCR管
• 加入1微升待測的細胞或組織裂解懸液（總量為250納克總蛋白；注意：嚴格避免RNA酶污染）
• 加入xx微升染色液（Reagent C）
• 加入xx微升補充液（Reagent D）到總量25微升
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 使用xx微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：參見注意事項9）
• 即刻放進熒光定量PCR儀
• 熒光定量PCR反應(yīng)程序為：

• 采集數(shù)據(jù)，進行溶解曲線分析
• PCR產(chǎn)物置于－20℃保存?zhèn)溆?/span>

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次PCR反應(yīng)
• 操作時，須戴手套
• 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀
• 建議整個操作在4℃下進行
• 必須使用帶濾芯的槍頭
• 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
• 使用時，避免污染母液
• 建議使用裂解液或無離子水作為陰性對照
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入GENMED封隔液（Reagent E）
• 配制完成后，即刻進行擴增反應(yīng)，以確保反應(yīng)物的活性
• 試劑避免反復(fù)凍融
• 通常樣品量范圍為1.6納克至1微克；理想范圍為250納克；如果沒有反應(yīng)，可能樣品中存在PCR抑制劑，建議調(diào)整樣品量為100至200納克
• PCR擴增反應(yīng)的初3個循環(huán)為定量基線；3至15個循環(huán)的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達到閾值所需的循環(huán)數(shù)為Ct值（參考圖像如下）：其中6號為陰性對照
• Ct值作為端粒酶活性的計量單位
• 用戶可以使用293細胞（10，100，和1000細胞數(shù)）作為陽性對照，以此建立標(biāo)準曲線：橫座標(biāo)（X軸）為細胞量對數(shù)，縱座標(biāo)（Y軸）為Ct值
• 如果檢測卵細胞樣品，建議平均每個卵細胞使用5微升GENMED裂解液（Reagent A）裂解細胞，孵育60分鐘，取1/10至1/20的卵細胞量，進行定量擴增反應(yīng)
• 本公司提供系列端粒酶活性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)靈敏