微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義

    乙酰輔酶 A 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過(guò)這條通路*氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP  合成。此外，乙酰輔酶A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測(cè)定原理

    蘋(píng)果酸脫氫酶可催化蘋(píng)果酸和NAD 生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋(píng)果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體 10uL×1 支，4℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 22.5mL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

工作液的配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.23  m  L），將試劑二、三和四按照 1:1:90 的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測(cè)定 96 樣）；加樣前置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

乙酰輔酶 A 的提取

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，用蒸餾水于 340nm 處調(diào)零。

2、 將工作液置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 10 min。

2、取 25μL 樣本和 230μL 工作液至微量石英比色皿或者 96 孔板，混勻，立即記錄 340nm

處 20s 的吸光值 A1 和 80s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

乙酰輔酶 A 含量計(jì)算

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。

注意：本試劑盒低檢測(cè)限為 1.6nmol/mL。

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)

÷W

(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

乙酰輔酶 A 含量(nmol/10⁴)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 3280x + 0.024；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。

注意：本試劑盒低檢測(cè)限為 1.6nmol/mL。

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA＋0.024) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

乙酰輔酶 A 含量（nmol/g 鮮重）=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)

÷W

(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

乙酰輔酶 A 含量（nmol/10⁴）=[(3280×ΔA＋0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)÷500

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

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