主要用途

細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物PLGLAR，在蛋白酶的水解下，解離抑制基團(tuán)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶（包括1、2、3、7、8、9、10、12、13、14等）的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

保存方式

保存底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）在-20℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

 1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備 

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)330nm，散發(fā)波長(zhǎng)400nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）；增益倍數(shù)100至200

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

4． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

5． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1至5號(hào)管

6． 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻

7． 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻

8． 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻

9． 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻

10． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、熒光測(cè)定 

1． 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

9． 標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)樣品值—背景對(duì)照值

10． 待測(cè)樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：5分鐘熒光讀數(shù)—背景對(duì)照熒光讀數(shù)

11． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

12． 活性計(jì)算：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘