主要用途

細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物PLGLAR，在特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP2蛋白酶的水解，解離抑制基團(tuán)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶2的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

保存方式

保存底物液（Reagent D）、標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）和專性液（Reagent F）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

黑色酶標(biāo)板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2. 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5. 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15. 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、熒光測(cè)定

（一）樣品總活性測(cè)定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品總活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中

3． 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

（二）樣品非特異活性測(cè)定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品非特異活性

2． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中

3． 加入xx微升專性液（Reagent F）到相應(yīng)孔中

4． 加入20微升待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘

6． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

7． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

8． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）

9． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

三、計(jì)算樣品活性

（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

（二） 樣品特異

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：

a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）

6． 如果用戶沒(méi)有特定的濾波器，可以使用激發(fā)波長(zhǎng)320至340nm之間的任一波長(zhǎng)，散發(fā)波長(zhǎng)390至420nm之間的任一波長(zhǎng)

7． 待測(cè)樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/50微升；待測(cè)樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

8． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

9． 如果檢測(cè)部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶2，則可以省去非特異活性檢測(cè)步驟

10． 基質(zhì)金屬蛋白酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位OA-Hy敏感性酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1納摩爾的多肽底物PLGLAR

11． 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品