注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。測(cè)定意義

二氫黃酮醇還原酶是類黃酮合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在決定植物的花色、葉色、果色和其他經(jīng)濟(jì)器官的色澤及其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面起著重要作用。

測(cè)定原理

二氫黃酮醇還原酶作用于二氫槲皮素產(chǎn)生兒茶素，可與香草醛縮合形成紅色化合物，在

500nm 處有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品

研缽、低溫離心機(jī)、震蕩儀、氮吹儀、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、濃鹽酸。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。試劑一：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 1.5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存，臨用前加 2mL 蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存，臨用前加入 30mL 濃鹽酸溶解待用；用不完的試劑 4℃ 避光保存。

酶液提取

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 500nm。

2、 操作表

酶活性計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在 30℃，pH7.5 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生 1mmol 兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V 反總÷（V 樣×Cpr ）÷T ÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在 30℃，pH7.5 條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生 1mmol 兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

DFR 活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T ÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在 30℃，pH7.5 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生 1mmol 兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V 反總÷（V 樣×Cpr ）÷T÷ 2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在 30℃，pH7.5 條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生 1mmol 兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

DFR 活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T ÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min