注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

方法：微量法

 貨號：H0101

規(guī)格:   100T/48S

 產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存，用前混勻即可；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

 產(chǎn)品說明：

PPO（EC1.10.3.1）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。

PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生鄰苯二醌，后者在 410nm 有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。

2、稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 410nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

PPO 活性計算：

1. 用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =60×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA÷0.01×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =60×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位的定義：每分鐘每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.01×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =0.12×ΔA

2. 用96 孔板測定的計算公式如下

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =120×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA÷0.005×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T =120×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位的定義：每分鐘每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中使 410nm 處吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.005×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =0.24×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，500 萬； T：反應(yīng)時間，10min。