分光光度法 50管/48樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸，同時還原NADP⁺生成NADPH。ICDHc是細胞質中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化。

測定原理：

利用ICDHc催化NADP⁺還原成NADPH反應，在340 nm下測定NADPH濃度的增加。

所需的儀器和用品:

紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理： 

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 將試劑二轉移至試劑一中充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預熱10min左右；用不完的試劑4℃保存。

3、 在試劑三中加入550μL蒸餾水充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預熱10min左右；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

4、 在試劑四中加入550μL蒸餾水充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預熱10min左右；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

5、 操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；混勻，在340nm波長下記錄20s時的初始吸光度A1和2min20s時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：

1、 若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

2、 若A2-A1小于0.005，可延長反應時間到5min或10min。

ICDHc活力單位的計算：

1、血清（漿）ICDHc活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=2143×ΔA

2、組織、細菌或細胞中ICDHc活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=2143×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（nmol/min /10⁴）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=4.285×ΔA

V反總：反應體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。