微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GSH/GSSG是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一。因此，測定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標(biāo)之一。

測定原理：

利用2-VP法測GSSG含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體600μL×1支，4℃保存。

試劑三：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑五： 液體15μL×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋，4℃保存。

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）混勻待測。

3. 血清等液體：直接測定。

GSSG含量測定：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫30min。

3.取1 mL EP管，加入100μ L上清液，5 μ L試劑二，蓋緊后混勻，得混合液，置于37℃水浴30min；取21μ L混合液于96孔板，然后依次加入20 μ L試劑四、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六，迅速混勻后，測定30 s和150 s光吸收A1和A2，計算ΔA=A2-A1。

GSSG含量計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣

=36.23×(ΔA+0.0011)

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20μL；V樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣×Cpr)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷V樣

=72.46×(ΔA+0.0011)

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20μL；V樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

注意事項(xiàng)：

1. 提取過程中去掉蛋白質(zhì)，所以提取液不能用于測定蛋白含量。

2. 臨用前配制的試劑配好后4℃保存，2天內(nèi)使用完畢。

3. 低檢出限為0.1μmol/L。

4. 反應(yīng)溫度嚴(yán)格來說，為保證重復(fù)性，應(yīng)在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。

5. 反應(yīng)時間需精確控制，否則會影響反應(yīng)速率計算，產(chǎn)生較大誤差。

6. 樣品中的GSSG濃度盡可能低一些，否則反應(yīng)速率太大，沒法控制，所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。