主要用途

細(xì)胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的過氧化物體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細(xì)胞的過氧化物體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于脂質(zhì)β-氧化、氨基酸代謝、糖脂和膽汁酸生物合成、蛋白組學(xué)和病理生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品。

保存方式

保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 動(dòng)物軟組織過氧化物體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）

10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

11． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g

12． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

13． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g

14． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管

15． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為25000g

16． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物

17． （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）

18． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g

19． （選擇步驟）小心抽去上清液

20． 加入xx毫升保存液（Reagent E），充分混勻

21． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動(dòng)物軟組織過氧化物體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入一個(gè)液氮凍存管

5． 即刻放入液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

8． 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液

9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

11． 加入xx微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）

12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）

14． 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻

15． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

16． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

17． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3500g

18． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管

19． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為25000g

20． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物

21． （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）

22． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為25000g

23． （選擇步驟）小心抽去上清液

24． 加入xx毫升保存液（Reagent E），充分混勻

25． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次（1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞）或50次（200毫克動(dòng)物組織或1 X 10⁷細(xì)胞）操作

2． 實(shí)際操作的動(dòng)物組織重量或細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如200毫克動(dòng)物組織：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一

3． 所有操作均須嚴(yán)格在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行

4． 操作時(shí)，須戴手套

5． 操作時(shí)，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）

6． 建議使用足夠的樣品量

7． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間

8． 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

9． 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)

10． 可見離心后出現(xiàn)的液面頂端的白色脂肪漂浮層，使用吸管或槍頭小心吸掉

11． 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

12． 通常1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞的過氧化物體含量為1毫克以上過氧化物體蛋白

13． 如果需要獲得99％以上純度的過氧化物體，使用細(xì)胞/組織高質(zhì)純化過氧化物體分離試劑盒－GMS10119.3 

14． 過氧化物體正?；钚詼y(cè)定方法是： CTALASE、HYDROXYPYRUVATE REDUCTASE等

15． 本公司提供系列過氧化物體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體內(nèi)外膜完整

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體維持正常活性

4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶